Corso di laurea magistrale in Chimica Clinica Forense e dello Sport

Discipline biochimiche e biologiche specialistiche

Il corso è mirato a completare la preparazione metodologica acquisita durante il corso di studi di primo livello nell’ambito biochimico-applicativo, con particolare riferimento agli aspetti legali e sanitari. Gli studenti dovranno dimostrare di: (1) Aver acquisito le competenze teoriche e pratiche per trattare campioni proteici; (2) Sapere applicate le tecniche analitiche generali (cromatografia e spettroscopia) precedentemente acquisite anche in altri corsi, alla caratterizzazione di campioni biologici, estraendo le informazioni necessarie al campo specifico della loro professionalizzazione (analisi forense, clinica ecc); (3) Conoscere le strategie di studio delle relazioni struttura/funzione nelle proteine e le loro implicazioni per patologie; (4) Avere una conoscenza e sapere valutare in quale particolare circostanza è necessario applicare tecniche specifiche e dedicate per l’analisi biochimica; (5) Valutare criticamente i risultati di analisi biochimiche su campioni di interesse forense o clinico (anche con analisi diretta di protocolli sperimentali che verranno proposti durante le lezioni); (6) Sfruttare le potenzialità fornite dagli enzimi e dalle proteine come specifici strumenti di analisi

Prova scritta

Metodi di trattamento del campione (1 CFU): Introduzione al corso. La preparazione dei campioni per l'analisi biochimica: tecniche di omogenizzazione estrazione e preparazione e scelta dei tamponi e detergenti per lo studio delle proteine. Uso delle tecniche elettroforetiche come strumento di controllo per la purezza delle frazioni proteiche. L'elettroforesi PAGE sia mono- che bi-dimensionale e l’isoelettrofocalizzazione analitica e preparativa. Richiamo alle tecniche cromatografiche più innovative per la separazione e frazionamento delle proteine (con particolare attenzione alla crom. di affinità). Dosaggio e quantificazione delle proteine. Metodi spettrofotometrici e colorimetrici (Lowry, Bradford, acido Bicinconinico). Metodi di analisi struttura/funzione (2 CFU): Identificazione e caratterizzazione delle proteine con esperimenti di binding. . Uso di radioisotopi beta emittenti e liquidi di scintillazione. L'effetto quenching. Impostazione di esperimenti di marcatura con radioisotopi e con sonde fluorescenti. Curve di saturazione, spiazzamento per competizione e definizione del legato specifico. Linearizzazione dei risultati secondo la procedura di Scatchard. Curve di saturazione e dosaggio dei siti. Misura delle Kd e relativa specificità. Caratterizzazione delle proteine enzimatiche. La cinetica di Michaelis -Menten e i metodi di linearizzazione più comuni: Lineweaver-Burke, Eadie-Hofstee e Haldane. L'inibizione da substrato e cinetiche relative. Cinetiche isosteriche e allosteriche. L'inbizione di tipo misto e la sua trattazione con i principali tipi di linearizzazione. Esercizi. I meccanismi a due substrati. Meccanismi sequenziali ordinati e non ordinati. Grafici di prima e di seconda derivazione e analisi qualitativa e quantitativa degli esperimenti. Applicazioni ai dosaggi enzimologici in chimica clinica (es delle transaminasi). Analisi della struttura primaria delle proteine: frammentazione con endoproteasi e metodi chimici e loro specificità, determinazione della sequenza aminoacidica tramite degradazione secondo Edman. Applicazioni dei metodi MS e MS/MS per il peptide fingerprinting e il de novo sequencing. Proteomica strutturale e funzionale. Separazione, quantificazione e identificazione delle proteine. Modificazioni co- e post-traduzionali. Protein profiling tramite protein chip e protein array (cenni). Applicazioni cliniche e biomediche del proteoma. Caratterizzazione e importanza delle glicoproteine e metodi di studio dedicati. Richiamo all’applicazione di metodi spettroscopici (CD, NMR, EPR, fluorescenza) per lo studio della struttura 2aria e 3aria delle proteine e determinazione della struttura tridimensionale. Meccanismi di Folding e misfolding di proteine di interesse medico: esempi di patologie da aggregazione proteica. Le proteine come strumento analitico (1CFU): Biosensori ottici e amperometrici: esempi di applicazione di sensori elettrochimici all'analisi di campioni biologici in tempo reale. Rilevamento di attività proteasiche specifiche. Esercitazione in aula informatica: risorse elettroniche per gli studi di biochimica e biologia molecolare. Databases annotati e algoritmi per la ricerca di omologia. Allineamenti multipli. L’analogia di sequenza come descrittore evoluzionistico dell’omologia funzionale. Programmi e risorse per la proteomica e le mappe 2DE. Files PDB e programmi di visualizzazione grafica e analisi della struttura 3D delle proteine. Esercitazione pratica in lab: dosaggio di attività enzimatica con metodo spettrofotometrico. Utilizzo di kit enzimatici. Illustrazione apparecchiature per elettroforesi 2D.

Appunti del corso e materiale bibliografico specialistico (articoli ISI) forniti durante le lezioni; A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli (2000); IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995); R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).