Corso di laurea magistrale in Chimica Clinica Forense e dello Sport

L'insegnamento è mirato a completare la preparazione metodologica acquisita durante il corso di studi di primo livello nell’ambito biochimico-applicativo, con particolare riferimento agli aspetti legali e sanitari. Vengono fornite le basi tecniche, i modelli matematici e approfondimenti su alcuni approcci all'avanguardia nel campo dello studio degli enzimi  e delle binding proteins come strumenti di analisi nel campo specifico clinico, forense e nel rilevamento di analiti di interesse. Si richiede anche che gli studenti dimostrino di sapere integrare teoria e pratica e l'insegnamento è articolato in modo da prevedere momenti di esercitazione  ediscussione critica. Viene anche proposta una attività di verifica opzionale integrativa (relazione scritta) che eserciti le capacità di presentazione di un report scientifico

Gli studenti dovranno dimostrare di: (1) Aver acquisito le competenze teoriche e pratiche per trattare campioni proteici; (2) Sapere applicare le tecniche analitiche generali (cromatografia e spettroscopia) precedentemente acquisite anche in altri corsi, alla caratterizzazione di campioni biologici, estraendo le informazioni necessarie al campo specifico della loro professionalizzazione (analisi forense, clinica ecc); (3) Conoscere le strategie di studio delle relazioni struttura/funzione nelle proteine e le loro implicazioni per patologie; (4) Avere una conoscenza e sapere valutare in quale particolare circostanza è necessario applicare tecniche specifiche e dedicate per l’analisi biochimica; (5) Valutare criticamente i risultati di analisi biochimiche su campioni di interesse forense o clinico (anche con analisi diretta di protocolli sperimentali che verranno proposti durante le lezioni); (6) Sfruttare le potenzialità fornite dagli enzimi e dalle proteine come specifici strumenti di analisi.

L'insegnamento prevede lezioni frontali in italiano, esercizi ed esercitazioni in aula e pratica in laboratorio su alcuni aspetti metodologici. Viene svolta anche una lezione al computer sulle risorse elettroniche dedicate alle metodologie biochimiche.

In sede di esame verranno valutate le conoscenze acquisite dallo studente ed il livello della loro comprensione in relazione al programma dell’insegnamento. Rientrano nella valutazione anche conoscenza e comprensione gli aspetti di chimica  e biochimica di base, così come l’utilizzo di un lessico appropriato.

L'esame si svolge come una prova scritta composta da due domande aperte, una argomentativa sui modelli matematici di analisi di substrarti e inibitori di enzimi e di ligandi di binding proteins e sui relatici approcci sperimentali e una di descrizione di una tematica specifica di approfondimento su una metodologia complessa di analisi biochimica con risvolti applicativi nel settore della LM. Inoltre viene somministrato un breve quiz su alcune conoscenze di base delle metodologie biochimiche. Gli studenti possono, in via facoltativa, stilare una relazione su un articolo di ricerca recente concordato con il docente. La relazione viene valutata con 1, 2 o 3 punti che si sommano alla votazione dell'esame.

Metodi di trattamento del campione (1 CFU): Introduzione al corso. La preparazione dei campioni per l'analisi biochimica: tecniche di omogenizzazione estrazione e preparazione e scelta dei tamponi e detergenti per lo studio delle proteine. Uso delle tecniche elettroforetiche come strumento di controllo per la purezza delle frazioni proteiche. L'elettroforesi PAGE sia mono- che bi-dimensionale e l’isoelettrofocalizzazione analitica e preparativa. Richiamo alle tecniche cromatografiche più innovative per la separazione e frazionamento delle proteine (con particolare attenzione alla crom. di affinità). Dosaggio e quantificazione delle proteine. Metodi spettrofotometrici e colorimetrici (Lowry, Bradford, acido Bicinconinico). Metodi di analisi struttura/funzione (2 CFU): Identificazione e caratterizzazione delle proteine con esperimenti di binding. . Uso di radioisotopi beta emittenti e liquidi di scintillazione. L'effetto quenching. Impostazione di esperimenti di marcatura con radioisotopi e con sonde fluorescenti. Curve di saturazione, spiazzamento per competizione e definizione del legato specifico. Linearizzazione dei risultati secondo la procedura di Scatchard. Curve di saturazione e dosaggio dei siti. Misura delle Kd e relativa specificità. Caratterizzazione delle proteine enzimatiche. La cinetica di Michaelis -Menten e i metodi di linearizzazione più comuni: Lineweaver-Burke, Eadie-Hofstee e Haldane. L'inibizione da substrato e cinetiche relative. Cinetiche isosteriche e allosteriche. L'inbizione di tipo misto e la sua trattazione con i principali tipi di linearizzazione. Esercizi. I meccanismi a due substrati. Meccanismi sequenziali ordinati e non ordinati. Grafici di prima e di seconda derivazione e analisi qualitativa e quantitativa degli esperimenti. Applicazioni ai dosaggi enzimologici in chimica clinica (es delle transaminasi). Analisi della struttura primaria delle proteine: frammentazione con endoproteasi e metodi chimici e loro specificità, determinazione della sequenza aminoacidica tramite degradazione secondo Edman. Applicazioni dei metodi MS e MS/MS per il peptide fingerprinting e il de novo sequencing. Proteomica strutturale e funzionale. Separazione, quantificazione e identificazione delle proteine. Modificazioni co- e post-traduzionali. Protein profiling tramite protein chip e protein array (cenni). Applicazioni cliniche e biomediche del proteoma. Caratterizzazione e importanza delle glicoproteine e metodi di studio dedicati. Richiamo all’applicazione di metodi spettroscopici (CD, NMR, EPR, fluorescenza) per lo studio della struttura 2aria e 3aria delle proteine e determinazione della struttura tridimensionale. Meccanismi di Folding e misfolding di proteine di interesse medico: esempi di patologie da aggregazione proteica. Le proteine come strumento analitico (1CFU): Biosensori ottici e amperometrici: esempi di applicazione di sensori elettrochimici all'analisi di campioni biologici in tempo reale. Rilevamento di attività proteasiche specifiche. Esercitazione in aula informatica: risorse elettroniche per gli studi di biochimica e biologia molecolare. Databases annotati e algoritmi per la ricerca di omologia. Allineamenti multipli. L’analogia di sequenza come descrittore evoluzionistico dell’omologia funzionale. Programmi e risorse per la proteomica e le mappe 2DE. Files PDB e programmi di visualizzazione grafica e analisi della struttura 3D delle proteine. Esercitazione pratica in lab: dosaggio di attività enzimatica con metodo spettrofotometrico. Utilizzo di kit enzimatici. Illustrazione apparecchiature per elettroforesi 2D.

Appunti del corso e materiale bibliografico specialistico (articoli ISI) forniti durante le lezioni; A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli (2000); IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995); R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).