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Oggetto:
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METODOLOGIE BIOCHIMICHE

Oggetto:

BIOCHEMICAL METHODS

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Anno accademico 2021/2022

Codice attività didattica
MFN0192
Docente
Dott. Francesca Valetti (Titolare del corso)
Corso di studio
Corso di laurea magistrale in Chimica Clinica Forense e dello Sport D.M. 270
Anno
1° anno
Periodo
Da definire
Tipologia
Caratterizzante
Crediti/Valenza
5
SSD attività didattica
BIO/10 - biochimica
Erogazione
Tradizionale
Lingua
Italiano
Frequenza
Facoltativa
Tipologia esame
Scritto
Oggetto:

Sommario del corso

Oggetto:

Obiettivi formativi

In accordo con gli obbiettivi formativi del corso di Laurea Magistrale, che  si propone di formare dei laureati che, oltre a solide conoscenze chimiche, maturino competenze in ambito biologico e biochimico, l'insegnamento è mirato a completare la preparazione metodologica e teorica  acquisita durante il corso di studi di primo livello nell'ambito biochimico-applicativo, con particolare riferimento agli aspetti legali e sanitari. Vengono fornite le basi tecniche, i modelli matematici e approfondimenti su alcuni approcci all'avanguardia nel campo dello studio degli enzimi  e delle binding proteins come strumenti di analisi nel campo specifico clinico, forense e nel rilevamento di analiti di interesse. Si richiede anche che gli studenti dimostrino di sapere integrare teoria e pratica e l'insegnamento è articolato in modo da prevedere momenti di esercitazione  ediscussione critica. Viene anche proposta una attività di verifica opzionale integrativa (relazione scritta) che eserciti le capacità di presentazione di un report scientifico, in accordo con quanto si prefigge il corso di Laurea Magistrale in termini di sviluppo della abilità comunicative

upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: Obiettivi formativi invariati

In agreement with the general aim of  the master course,  which is preparing students to integrate their sound chemical background with knowledge and skills in the biological and biochemical field,  the course integrates the basis in biochemistry providing further  skills, competences and updates in biochemical methods, with particular reference to the legal and health aspects. The course covers the basics of methods in biochemistry as well as mathematical models for enzymes and binding proteins studies, in particular referring to applications in clinics, forensic science s and analytical chemistry. Students must integrate theory and practice and the course is organised accordingly (lectures, practicals, discussions). The assay is proposed to challenge the scientific report writing expertise of students in agreement with the general master course aim of developing students communication skills.

upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: No changes

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Risultati dell'apprendimento attesi

I risultati dell'apprendimento attesi sono in accordo con quanto descritto nella scheda SUA per quanto riguarda l'area Biochimica Biologica. In particolare gli studenti dovranno dimostrare di:

(1) Aver acquisito le competenze teoriche e pratiche per trattare campioni proteici;

(2) Sapere applicare le tecniche analitiche generali precedentemente acquisite anche in altri corsi, alla caratterizzazione di campioni biologici, estraendo le informazioni necessarie al campo specifico della loro professionalizzazione (analisi forense, clinica ecc);

(3) Conoscere le strategie di studio delle relazioni struttura/funzione nelle proteine e le loro implicazioni per patologie;

(4) Avere una conoscenza e sapere valutare in quale particolare circostanza è necessario applicare tecniche specifiche e dedicate per l'analisi biochimica;

(5) Valutare criticamente i risultati di analisi biochimiche su campioni di interesse forense o clinico (anche con analisi diretta di protocolli sperimentali che verranno proposti durante le lezioni);

(6) Sfruttare le potenzialità fornite dagli enzimi e dalle proteine come specifici strumenti di analisi.

upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: Risultati dell'apprendimenti attesi invariati

Students must demonstrate:

(1) Theoretical and practical skills to work with protein samples;

(2) General Knowledge of applied analytical techniques previously acquired in other courses, the characterization of biological samples, extracting the information required for the specific field of their professionalisation (forensic, clinical, etc.)

(3) Knowledge of strategies for the study of structure / function relationships in proteins and their implications for disease;

(4) Understanding and knowledge to assess to what particular circumstance it is necessary to apply specific techniques dedicated to the analysis and biochemistry;

(5) Critically evaluate the results of biochemical analyzes on samples of forensic interest or clinical (including direct analysis of experimental protocols that will be offered during the classes);

(6) Using the potential provided by the enzymes and proteins as specific analysis tools

upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: No changes

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Programma

Metodi di trattamento del campione (1 CFU): Introduzione al corso. La preparazione dei campioni per l'analisi biochimica: tecniche di omogenizzazione estrazione e preparazione e scelta dei tamponi e detergenti per lo studio delle proteine. Uso delle tecniche elettroforetiche come strumento di controllo per la purezza delle frazioni proteiche. L'elettroforesi PAGE sia mono- che bi-dimensionale e l'isoelettrofocalizzazione analitica e preparativa.  Dosaggio e quantificazione delle proteine. Metodi spettrofotometrici e colorimetrici (Lowry, Bradford, acido Bicinconinico).

Metodi di analisi di cinetica enzimatica e binding  (2 CFU): Identificazione e caratterizzazione delle proteine con esperimenti di binding. . Uso di radioisotopi beta emittenti e liquidi di scintillazione. L'effetto quenching. Impostazione di esperimenti di marcatura con radioisotopi e con sonde fluorescenti. Curve di saturazione, spiazzamento per competizione e definizione del legato specifico. Linearizzazione dei risultati secondo la procedura di Scatchard. Curve di saturazione e dosaggio dei siti. Misura delle Kd e relativa specificità. Correlazione Ki  con IC50. Caratterizzazione delle proteine enzimatiche. La cinetica di Michaelis -Menten e i metodi di linearizzazione più comuni: Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee e Haldane. L'inibizione da substrato e cinetiche relative. Cinetiche isosteriche e allosteriche. L'inbizione di tipo misto e la sua trattazione con i principali tipi di linearizzazione. Esercizi. I meccanismi a due substrati. Meccanismi sequenziali ordinati e non ordinati. 

Metodi di studio struttura/funzione: 1,5 CFU Analisi della struttura primaria delle proteine: frammentazione con endoproteasi e metodi chimici e loro specificità, determinazione della sequenza aminoacidica tramite degradazione secondo Edman. Applicazioni dei metodi MS e MS/MS per il peptide fingerprinting e il de novo sequencing. Proteomica strutturale e funzionale. Separazione, quantificazione e identificazione delle proteine. Modificazioni co- e post-traduzionali. Protein profiling tramite protein chip e protein array (cenni). Applicazioni cliniche e biomediche del proteoma. Caratterizzazione e importanza delle glicoproteine e metodi di studio dedicati. Richiamo all'applicazione di metodi spettroscopici (CD, NMR, EPR, fluorescenza) per lo studio della struttura 2aria e 3aria delle proteine e determinazione della struttura tridimensionale. Meccanismi di Folding e misfolding di proteine di interesse medico: esempi di patologie da aggregazione proteica. Le proteine come strumento analitico: Biosensori ottici e amperometrici: esempi di applicazione di sensori elettrochimici all'analisi di campioni biologici in tempo reale. Rilevamento di attività proteasiche specifiche.

Esercitazione in aula informatica (4h): risorse elettroniche per gli studi di biochimica e biologia molecolare. Databases annotati e algoritmi per la ricerca di omologia. Allineamenti multipli. L'analogia di sequenza come descrittore evoluzionistico dell'omologia funzionale. Programmi e risorse per la proteomica e le mappe 2DE. Files PDB e programmi di visualizzazione grafica e analisi della struttura 3D delle proteine.

Esercitazione pratica in lab (4+4h): dosaggio di attività enzimatica con metodo spettrofotometrico. Utilizzo di kit enzimatici. Illustrazione apparecchiature per elettroforesi 2D.

upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: Programma invariato, le esercitazioni in laboratorio saranno sostitute se necessario da video e attività di eleborazione dati che simulino il più possibile le skills pratiche acquisibili in presenza

Protein sample treatment (1 CFU): Sample preparation for biochemical analysis, protein compatible buffers and detergents. Electrophoresis techniques for purity check. PAGE, IEF and 2D electrophoresis.  Protein assay for quantitation (Lowry, Bradford, Bicinchonic Acid ). Methods in enzyme kinetics and protein binding (2 CFU): Identification and characterisation of protein via binding experiments. Radioisotopes and fluorophores for ligand labelling. Quenching effects. Planning binding experiments: saturation curves, competing effects, specifically bound ligand quantitation. Scatchard plot. Binding sites number calculations. Kd and specificity. Enzyme characterisation: the Michaelis -Menten kinetics and linearisation methods: Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee and Haldane. Substrate inhibition effect. Isosteric and allosteric kinetics. Inhibitors (competitive, acompetitive and mixed effects with dedicated exercises and problems). Two substrates mechanisms. Examples of applications to enzyme assays for clinical chemistry (i.e transaminases) Structure/function study methods (1,5 CFU) Protein primary structure analysis: proteases digestion, protein sequencing methods with Edman reaction. MS and MS/MS methods for peptide fingerprinting and de novo sequencing. Structural and functional proteomics, quantification and identification of proteins and post-translational modifications. Protein profiling with protein chip and protein array (brief overview). Proteomics clinical and biomedical applications. Glycoprotein relevance and specific characterisation methods. Spectroscopy for protein 2ary and 3ary structure studies. Protein folding and misfolding mechanisms and correlation with protein aggregation in degenerative diseases (Alzheimer, prionic pathologies). Protein as analytical tools: Optical and amperometric biosensors: examples of electrochemical sensors for realtime analytes detection. Detection of specific proteases. Practicals: electronics resources for biochemistry. Annotated databases and algorithms for protein homology. Multiple alignments. Protein sequence homology and functional homology. Websites and datebeses for proteomics (4h): peptide identification and 2DE maps. PDB files and visual graphics programs for 3D protein structure. Lab Practicals (4+4 h): enzyme activity assay by spectrophotometric methods. Enzyme based kits for analyte detection. 2D electrophoresis setup.

upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: No changes. Lab activities will be replaced if bnecessary with videos and simulations of experimenal planning and data organisation in order for students to acquire as much as possible the same lab skills

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Modalità di insegnamento

L'insegnamento prevede lezioni frontali in italiano, esercizi ed esercitazioni in aula e pratica in laboratorio su alcuni aspetti metodologici (SDS-PAGE e dosaggio di proteine). Viene svolta anche una lezione al computer sulle risorse elettroniche dedicate alle metodologie biochimiche.

upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: Il corso è erogato in aula come da calendario e in modalità a distanza tramite didattica in sincrono collegandosi al sito

https://unito.webex.com/meet/francesca.valetti

Le registrazioni di ogni lezione saranno rese disponbili pubblicando il link su Campusnet e Moodle

  • Valutazione formativa: mentimeter e socrative
  • Comunicazione con gli studenti: email per domande di carattere personale

The course is held in italian and based on lectures, practicals in lab (SDS_PAGE, protein assay), exercises. Web resources for biochemical methods are illustrated in a computer-based lecture (tutorial: one computer per student)

  • upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: E-learning via streaming at https://unito.webex.com/meet/francesca.valetti
  • recorded lectures provided on Moodle and Campusnet

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Modalità di verifica dell'apprendimento

In sede di esame verranno valutate le conoscenze acquisite dallo studente ed il livello della loro comprensione in relazione al programma dell'insegnamento. Rientrano nella valutazione anche conoscenza e comprensione gli aspetti di chimica  e biochimica di base, così come l'utilizzo di un lessico appropriato.

L'esame si svolge come una prova scritta composta da due domande aperte, una argomentativa sui modelli matematici di analisi di substrarti e inibitori di enzimi e di ligandi di binding proteins e sui relatici approcci sperimentali e una di descrizione di una tematica specifica di approfondimento su una metodologia complessa di analisi biochimica con risvolti applicativi nel settore della LM. Inoltre viene somministrato un breve quiz su alcune conoscenze di base delle metodologie biochimiche. Gli studenti possono, in via facoltativa, stilare una relazione su un articolo di ricerca recente concordato con il docente. La relazione viene valutata con 1, 2 o 3 punti che si sommano alla votazione dell'esame. La relazione deve tassativamente essere presentata entro la scadenza indicata (normalmente fine febbraio dell'AA di svolgimento del corso)

upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: L'esame verrà effettuato in modalità orale, con 2 domande aperte simili alla modalità scritta in cui verranno soprattutto valutate le capacità di ragionamento, tramite WebEx con videocamera accesa. La possibilità di consegnare la relazione rimane invariata.

 

The exam is devoted to the assessment of the knowledge, and related understanding, of the program attained by the students. In addition, also knowledge and understanding of basic knowledge in Chemistry and Biochemistry  will be evaluated, as well as the use of a proper  scientific/technical language.

There is a written exam with two questions; one on the methematical models for enzyme and binding proteins syudies, including the experimental setup, and a second on a specific technique for advanced protein studies in the fields specifically realated to the subject of the degree course. During the exam also a brief written test is dedicated to few basic concepts of biochemistry methods.

Students can also present in addition (not compulsory) a written assay on a recent research paper. The assay will be avaluated fro 1 to 3 point that are added to the mark of the written exam.

upload_Coronavirus-2019-nCoV-CDC-23312_without_background.png DIDATTICA ALTERNATIVA: Oral test, via WebEx, replacing the written test with the same content. A special attention will be given to the student's answers based on reasoning more than memory. The additional written assay possibility is not changed, but it must be sent before the fixed deadine.

Testi consigliati e bibliografia

Oggetto:

Appunti del corso e materiale bibliografico specialistico (articoli ISI) forniti durante le lezioni; A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli (2000); IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995); R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).
Slides and bibliography (recent papers) will be provided on the website and during the course. Reference textbooks. A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli (2000); IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995); R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).



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    Ultimo aggiornamento: 05/10/2021 08:59
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